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188足球体育投注:事半功倍的层析柱使用技巧

来源:188体育手机投注 作者:188体育app下载 时间:2022-09-27 12:39:41

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  • 产品介绍

    INTRODUCTION

      层析柱是层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管。根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同,从而分离的一种层析法。选柱子:有玻璃柱和不锈钢柱两种,实验室常用玻璃柱。径高比一般在1:5-10。 根据吸附剂用量(体积)确定柱子大小,一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4-1/5。

      压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。

      减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。

      加压柱是种比较好的方法,与常压柱类似,只是外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或小气泵。特别在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

      柱子的尺寸为粗长的最好。柱子越长,相应的塔板数就越高。柱子越,上样后样品的原点就越小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。

      无水无氧柱适用于对氧、水敏感,易分解的产品。可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能使产品分解,毕竟要分离的是敏感的物质,小心不为过。因为分离的物质比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。

      无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝有碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但比硅胶要贵些。听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过。

      选择吸附剂:200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的视密度在0.4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以。

      推荐硅胶量是样品量的30-40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在0.2-0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶。

      用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。

      常用吸附剂的种类:氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙(镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。

      (1)氧化铝:市售层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三类,粒度规格大多为100-150目。

      碱性氧化铝(pH9—10):适用于碱性物质(如胺、生物碱)和对酸敏感的样品(如缩醛、糖苷等),也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以,这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。

      酸性氧化铝(pH3.5—4.5):适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。

      中性氧化铝(pH7—7.5):适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离,也可以用来分离弱的有机酸和碱等。

      (2)硅胶:硅胶是硅酸的部分脱水后的产物,其成分是SiO2·xH2O,又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。

      适用范围:非极性和极性化合物,适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸,及一系列合成产品如有机金属化合物等。

      (3)聚酰胺:色谱用聚酰胺主要有锦纶6(聚己内酰胺)和锦纶66(聚己二酰己二胺)两种,分子量一般在16000-20000,其亲水性和亲脂性均较好,因此既可分离水溶性成份,也可分离脂溶性成分。

      可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中;微溶于乙酸和苯酚等;不溶于醇、氯仿、丙酮、、苯等;对碱稳定,对强酸可水解。

      分离对象:能与聚酰胺形成氢键的化合物,如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。

      形成氢键的基团(如酚经基、按基、酪基、硝基等)越多,吸附力越强。如丁二酸>丁酸 形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大,邻位使吸附力减小。芳香核、共轭双键多者吸附力大,少者吸附力小。若形成分子内氢键,则使化合物的吸附力减小。

      (4)硅酸镁:中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间,主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁,用前先用稀盐酸,然后用醋酸洗涤,最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。

      柱层析的装柱非常重要,装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单,使用也最普遍, 就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆,柱子底部先用脱脂棉塞紧, 然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。

      用漏斗将活好的固定相倒入柱子中, 打开底部活塞, 将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打, 将固定相敲实, 做到密实均匀无气泡即可。

      干法装柱与湿法装柱刚好相反的是,它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中, 然后用油泵抽柱子底部, 相当于减压过柱, 直到柱子变得很结实, 再用淋洗剂“走柱子” 。

      干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后, 由于溶剂和固定相之间的吸附放热, 所以柱子容易变花,影响分离效果。

      (2)一定要用较多的溶剂“走柱子”,直到柱子的下端不再发烫, 恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱,最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。

      上样也有湿法和干法之分:湿法一般用淋洗剂溶解样品, 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等, 但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。

      在不用海沙的情况下, 尽量不要破坏硅胶面。加样后, 打开柱底活塞, 让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂,再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。

      然后就可以放心地加入大量洗脱剂, 而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的, 一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现, 是因为硅胶对样品的吸附饱和, 而样品本身又是比较好的固体才会析出, 这就需要先重结晶样品, 得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。

      如果不能重结晶也没关系,直接过柱就行, 样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解, 最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如 DMF,DMSO等, 会随着溶剂一起走, 显色是一个很长的脱尾) , 这时就必须用干法上柱了。

      干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,在加入少量硅胶, 拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1:1 的量混合, 硅胶使用的量也可以少一些, 但是要保证在旋干后, 不能看到明显的固体颗粒,让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中, 加入洗脱剂洗脱。

      柱层析按过柱时的压力可以分为:加压, 常压, 减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度, 减少产品收集的时间, 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的, 但是时间也最长, 例如一些天然化合物的分离,有时一个柱子过几个月也有可能。

      减压柱能够减少硅胶的使用量,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发, 有时会在柱子外面有水汽凝结, 另外有些比较易分解的东西可能得不到, 而且还必须同时使用水泵抽气, 噪音大, 时间长, 所以减压过柱用得比较少。

      加压过柱是一种比较好的方法, 与常压柱类似, 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵 (用鱼缸供气的加压泵就行)。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。

      一般压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高, 分离效果较好, 所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。

      一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡, 使柱子变花, 利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题, 而且可以使柱子很快装实。

      随着科技的发展, 色谱法的技术也日新月异, 但柱层析实验技术还是比较简单和实用的, 每个科研工作者在使用柱层析时, 可以根据自己的实际情况来不断地摸索,不断地总结和提高柱层析的实验技术。

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